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Sulfo CY3-DBCO，CAS:1782950-79-1制備成空心微針遞送合成mRNA的文獻(xiàn)分享

Sulfo CY3-DBCO（磺酸化CY3-DBCO）

Sulfo CY3-DBCO 是一種水溶性熒光染料，用于銅離子自由的點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)。它結(jié)合了Sulfo-CY3（磺酸化Cyanine 3，激發(fā)波長(zhǎng)550 nm，發(fā)射波長(zhǎng)570 nm）與DBCO（雙環(huán)辛炔）功能團(tuán)，后者可與疊氮類物質(zhì)進(jìn)行快速、特異性的 SPAAC 反應(yīng)（應(yīng)變促進(jìn)的疊氮-炔點(diǎn)擊反應(yīng)）。由于其磺酸基團(tuán)增強(qiáng)了水溶性，Sulfo CY3-DBCO 非常適用于在水性體系中標(biāo)記蛋白、抗體、核酸和多糖類疊氮修飾物。它在細(xì)胞標(biāo)記、活體成像、生物共軛等研究中具有廣泛應(yīng)用，尤其適合于無(wú)需催化劑的生物體系中。

一、基本信息

名稱：Sulfo-CY3-DBCO

中文名稱：磺酸化CY3-DBCO熒光探針

CAS:1782950-79-1

分子量：889

性狀：紅色粉末

結(jié)構(gòu)：

應(yīng)用：

1、細(xì)胞標(biāo)記和成像：將Sulfo-CY3 DBCO與含有疊氮官能團(tuán)的生物分子共價(jià)偶聯(lián)，然后用于細(xì)胞成像實(shí)驗(yàn)，可視化特定生物分子的位置和分布。

2、蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用研究：Sulfo-CY3 DBCO可用于標(biāo)記蛋白質(zhì)，以研究蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用和信號(hào)通路。

3、生物傳感：制備分子探針和生物傳感器，用于檢測(cè)生物樣本中特定生物分子的存在和濃度變化。

文獻(xiàn)：

文章來(lái)源：

https://www.cell.com/molecular-therapy-family/nucleic-acids/fulltext/S2162-2531(18)30035-0

文章來(lái)源：

https://www.cell.com/molecular-therapy-family/nucleic-acids/fulltext/S2162-2531(18)30035-0

作者：

Sonia Golombek ? Martin Pilz ? Heidrun Steinle ? Efrat Kochba ? Yotam Levin ? Dominique Lunter ? Christian Schlensak ? Hans Peter Wende ? Meltem Avci-Adali

摘要：

近年來(lái)，基于合成mRNA在細(xì)胞中生產(chǎn)所需外源蛋白的應(yīng)用越來(lái)越重要。然而，合成mRNA的全身遞送可能導(dǎo)致非特異性攝取到不需要的細(xì)胞或器官中，從而無(wú)法靶向所需的細(xì)胞。因此，合成mRNA的局部和靶向遞送對(duì)于到達(dá)所需的細(xì)胞類型和組織變得越來(lái)越重要。在這項(xiàng)研究中，評(píng)估了使用基于中空微針注射的方法進(jìn)行合成mRNA皮內(nèi)遞送。此外，建立了離體豬皮模型，以分析皮內(nèi)給藥后皮膚中合成的mRNA介導(dǎo)的蛋白質(zhì)表達(dá)。使用該模型，證明了合成mRNA的高效遞送，這導(dǎo)致檢測(cè)到由微量注射的合成mRNA編碼的高水平可分泌的人源化Gaussia螢光素酶（hGLuc）蛋白。有趣的是，在沒(méi)有轉(zhuǎn)染試劑的情況下注射的合成信使核糖核酸也能夠進(jìn)入細(xì)胞并導(dǎo)致蛋白質(zhì)表達(dá)。在開(kāi)始體內(nèi)實(shí)驗(yàn)之前，建立的離體豬皮模型可用于評(píng)估皮內(nèi)遞送合成mRNAs后所需蛋白質(zhì)的成功生產(chǎn)。此外，微針的使用使合成mRNAs能夠友好、無(wú)痛、高效地輸送到真皮中；因此，該方法可用于不同皮膚病的局部治療以及疫苗接種和免疫治療。

方法：

合成hGLuc mRNA的Cy3標(biāo)記

通過(guò)無(wú)Cu（I）（DBCO）點(diǎn)擊化學(xué)對(duì)合成mRNA進(jìn)行Cy3標(biāo)記。首先，在IVT期間將5-疊氮基-C3-UTP摻入合成mRNA中，隨后通過(guò)與DBCO-Sulfo-Cy3孵育將Cy3與5-疊氮基-C3-UTPs結(jié)合。因此，在IVT期間，使用1.9 mM 5-疊氮基-C3-UTP（德國(guó)耶拿市耶拿生物科學(xué)公司）和5.6 mM偽UTP代替7.5 mM假UTP。根據(jù)制造商的說(shuō)明，使用RNeasy MinElute凈化試劑盒（QIAGEN）純化IVT反應(yīng)混合物。隨后，在37°C下，將5-疊氮-C3-UTP修飾的mRNA與總量為5倍摩爾過(guò)量的DBCO-Sulfo-Cy3（Jena Bioscience）一起孵育1小時(shí)，用無(wú)核酸酶的水調(diào)節(jié)。使用數(shù)據(jù)表計(jì)算DBCO-Sulfoo-Cy3的摩爾量與疊氮標(biāo)記的mRNA的量的關(guān)系。使用RNeasy MinElute凈化試劑盒（QIAGEN）再次純化反應(yīng)混合物，通過(guò)1%瓊脂糖凝膠電泳和在室溫（RT）下用1×GelRed在三硼酸EDTA（TBE）中染色30分鐘來(lái)驗(yàn)證mRNA的純度。使用光度計(jì)測(cè)定濃度，并將mRNA儲(chǔ)存在-80°C下。

結(jié)論：

Synthesis of hGLuc-Encoding mRNA and Labeling with Cy3

hGLuc編碼mRNA的合成及Cy3標(biāo)記

此外，為了能夠在皮內(nèi)遞送后檢測(cè)合成的 mRNA，使用無(wú) Cu(I) 的疊氮化物-二芐基環(huán)辛炔 (DBCO) 點(diǎn)擊化學(xué)將 hGLuc mRNA 標(biāo)記為 Cy3，其中 Cy3 分子在IVT后與合成 mRNA 中摻入的 5-疊氮基-C 3 -尿苷三磷酸 (UTP) 結(jié)合。在圖 1 B 中，使用紫外透射儀可以清晰地看到 Cy3 標(biāo)記的 mRNA 帶。在約 900 個(gè)堿基長(zhǎng)度處檢測(cè)到*強(qiáng)的熒光信號(hào)。然而，還可以看到另外兩個(gè)在 1.5 和 2 kb 處的弱帶。出現(xiàn)多個(gè) Cy3 標(biāo)記帶的原因可能是結(jié)合的 Cy3 分子的數(shù)量。每個(gè) mRNA 的 Cy3 分子數(shù)量越多，分子量就越大。未加Cy3標(biāo)記的mRNA經(jīng)GelRed染色后可清晰檢測(cè)到，且與強(qiáng)度*高的Cy3標(biāo)記的hGLuc mRNA處于同一高度。

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